Struktur eines Nukleosoms

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5075 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Gene, die für die Kernmaschinerie des Zellzyklus kodieren, werden durch die Proteinkomplexe der MuvB-Familie auf zellzyklusspezifische Weise transkriptionell reguliert. Komplexe von MuvB mit den Transkriptionsfaktoren B-MYB und FOXM1 aktivieren mitotische Gene während der Zellproliferation. Die Mechanismen der Transkriptionsregulation durch diese Komplexe sind noch unzureichend charakterisiert. Hier kombinieren wir biochemische Analyse und In-vitro-Rekonstitution mit Strukturanalyse mittels Kryo-Elektronenmikroskopie und Vernetzungsmassenspektrometrie, um diese Komplexe funktionell zu untersuchen. Wir stellen fest, dass der MuvB:B-MYB-Komplex Nukleosomen bindet und umgestaltet und dadurch nukleosomale DNA freilegt. Diese Umbauaktivität wird durch B-MYB unterstützt, das die umgestaltete DNA direkt bindet. Angesichts der Umbauaktivität am Nukleosom schlagen wir vor, dass der MuvB:B-MYB-Komplex als Pionier-Transkriptionsfaktorkomplex fungiert. In dieser Arbeit rationalisieren wir frühere biochemische und zelluläre Studien und stellen ein molekulares Gerüst für Wechselwirkungen an einem Proteinkomplex bereit, der für die Regulierung des Zellzyklus von entscheidender Bedeutung ist.

Während des Zellzyklus repliziert eine Zelle ihr Genom in zwei identische Kopien und koordiniert die Chromosomentrennung mit der Zellteilung. Der geordnete Ablauf durch die verschiedenen Phasen des Zellzyklus beruht auf dem Cyclin-abhängigen Kinase-Cyclin-Oszillator (CDK-Cyclin), der nacheinander Zellzyklusübergänge durch Phosphorylierung spezifischer Ziele, einschließlich der nachgeschalteten Effektoren des Zellzyklus, auslöst. Die oszillierende Aktivität der CDK-Cycline wird durch zellzyklusspezifische Proteinubiquitinierung, Phosphorylierung und Transkriptionsregulation erreicht1,2.

Die zellzyklusabhängige Transkription von Zellzyklusgenen wird durch die MuvB-Familie von Transkriptionsregulatoren gesteuert3,4,5. Der MuvB-Kernkomplex besteht aus einer Hauptgerüstuntereinheit namens LIN9, dem Histon-bindenden Protein RbBP4, dem DNA-bindenden Protein LIN54 und den kleineren Untereinheiten LIN37 und LIN526. Die DNA-bindende Domäne von LIN54 rekrutiert MuvB für seine Zielgene an einer spezifischen Sequenz, die als Zellzyklus-Homologieregion (CHR)7,8 bezeichnet wird. MuvB-Zielpromotoren sind TATA-frei und der CHR befindet sich direkt stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle (TSS) und dem +1-Nukleosom8,9. Das Vorhandensein des +1-Nukleosoms erzeugt eine Barriere für den Aufbau des basalen Transkriptionsapparats10, und seine Positionierung und Dynamik werden genau reguliert, um den Transkriptionsstatus jedes Gens zu definieren. Auch wenn die Mechanismen der Regulation des +1-Nukleosoms nicht vollständig verstanden sind und Gegenstand intensiver Forschung sind11, deuten die Lage des CHR und mehrere Studien7,9,12 darauf hin, dass MuvB-Komplexe, die sowohl eine aktivierende als auch eine repressive Rolle spielen, dies sein könnten an diesem Prozess beteiligt sind.

Während des Austritts des Zellzyklus im Ruhezustand und im Alter, auch bekannt als G0, interagiert der MuvB-Komplex mit einem Retinoblastom-ähnlichen Protein und bildet so den DREAM-Komplex3,4,13, der die Transkriptionsrepression von etwa 1000 Genen des Zellzyklus vermittelt6. Die Erkennung der Zielgene durch den DREAM-Komplex ist kombinatorisch, da sie die Bindung eines CHR und eines vorgeschalteten zellzyklusabhängigen Elements (CDE) beinhaltet2,14,15.

Wenn die Zelle zur Teilung verpflichtet ist, fördert die zunehmende Aktivität von CDK2-Cylin D und E am G1-S-Übergang die Hyperphosphorylierung der Retionoblastom-ähnlichen Proteine16,17 und verursacht dadurch die Auflösung von DREAM und den Wiedereintritt in den Zellzyklus16,18 ,19. Der verbleibende CHR-gebundene MuvB-Kernkomplex assoziiert während der S-Phase nacheinander mit B-MYB- und FOXM1-Transkriptionsfaktoren (TFs)20. B-MYB und FOXM1 sind Onkogene und werden bei mehreren Krebsarten überexprimiert21,22,23,24. Der sequentielle Zusammenbau von B-MYB und FOXM1 auf dem MuvB-Komplex an CHR-Elementen ist erforderlich, um die Transkriptionsaktivierung des mitotischen Genprogramms in der G2-Phase auszulösen20,25,26. Wichtig ist, dass der Komplex aus B-MYB und MuvB (MMB) für die Rekrutierung von FOXM1 an Zellzyklus-Genen erforderlich ist. Daher wurde B-MYB als Pionier-TF für die zellzyklusabhängige Transkription von G2/M-Genen definiert20,27.

Der molekulare Mechanismus der MuvB-abhängigen Genrepression oder -aktivierung ist kaum verstanden, und die Stöchiometrie und die Gesamtarchitektur dieses Komplexes sind unklar.

Das Vorhandensein des Histon-bindenden Proteins RbBP4, das von mehreren Chromatin-Regulatorkomplexen gemeinsam genutzt wird2,28,29,30, legt nahe, dass dieser Komplex an der Regulierung der Chromatinstruktur beteiligt ist, aber das Fehlen einer ATPase-Domäne in MuvB deutet darauf hin ist nicht am ATP-abhängigen Chromatin-Remodelling beteiligt. Viele Chromatin-regulierende Komplexe funktionieren ATP-unabhängig. Beispielsweise nutzt der repressive Komplex 1 (PRC1) von Polycomb die Oligomerisierung als Teil seines Hemmmechanismus31,32,33; Pionier-Transkriptionsfaktoren schaffen Kompetenz für die Genexpression, indem sie die nukleosomale DNA binden und den Chromatin-Remodelling initiieren, wodurch zusätzliche nukleosomale DNA den nachgeschalteten TFs und dem Transkriptionsapparat ausgesetzt wird34,35,36,37,38. Histon-Chaperone unterstützen den Auf- und Abbau von Nukleosomen während der Transkription, DNA-Replikation und Reparatur39,40. Es ist nicht bekannt, ob der MuvB-Komplex einen der oben aufgeführten Mechanismen zur Aktivierung seiner transkriptionsregulierenden Funktionen nutzen könnte.

Hier wollten wir untersuchen, ob MuvB einen dieser bekannten ATP-unabhängigen Chromatin-Remodellierungsmechanismen oder möglicherweise einen zuvor unbeschriebenen Mechanismus verwendet. Daher haben wir mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) eine strukturelle Momentaufnahme eines MuvB-Komplexes in Aktion während des Umbaus eines Nukleosoms erstellt und dessen Stöchiometrie, Anordnung und Chromatinbindung definiert. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass MMB ein Pionier-Transkriptionsfaktor ist, und wir leiten ein Modell ab, nach dem seine Nukleosomen-Remodellierungsaktivität zur Transkriptionsaktivierung im Zusammenhang mit der Zellproliferation beitragen könnte.

Angesichts der überzeugenden Beweise dafür, dass der MuvB-Komplex an der Nukleosomenbindung in der Nähe des CHR-haltigen Promotors der Zielgene beteiligt ist7,9,12, beschlossen wir, die Rekonstitution mehrerer MuvB-Komplexe mit dem Nukleosom zu versuchen. Wir haben alle Untereinheiten des MuvB-Komplexes rekombinant exprimiert, einschließlich LIN9, LIN37, LIN52, RbBP4 und einer Kurzversion von LIN54 (LIN54sh), bei der der nicht konservierte N-Terminus in einer Baculovirus-/Insektenzellexpression entfernt wurde (Abb. 1a). System. Dies führte zur Herstellung eines hochreinen Proteinkomplexes, der in der Größenausschlusschromatographie (SEC) in einem scharfen und symmetrischen Peak eluierte (ergänzende Abbildung 1a).

a Schematische Darstellung der Domänen und funktionellen Regionen auf den Untereinheiten des MMB-Komplexes, dargestellt in linearer Form. Der N-Terminus von B-MYB, der eine DNA-Bindungsdomäne enthält, ist in der Kryo-EM-Struktur ungeordnet und wird durch verblassende Farben dargestellt. LIN54 ist mit gestrichelten Linien dargestellt, um zu verdeutlichen, dass dieses Protein nicht in der Kernstruktur von MMB (MMBcore):Nukleosomen enthalten war. Das in dieser Abbildung verwendete Farbschema der NCP-Untereinheit ist für jedes Histon und jede DNA angegeben. b, c Cartoon-Darstellungen von zwei Hauptansichten des MMBcore:Nukleosom-Komplexes, die die Gesamtarchitektur des Komplexes zeigen. Superhelicale (SHL) Positionen in Bezug auf die Nukleosomen-Dyade (0) sind in (b) markiert. Der DNA-Ein- und -Austritt wird ebenfalls angezeigt. Die MMBcore-Bindung erstreckt sich über drei SHL-Positionen (–8 bis –6).

Um die Interaktion zwischen MuvB und dem Nukleosom spezifisch und unabhängig von der MuvB-CHR-Bindungsfunktion zu analysieren, haben wir einen MuvB-Komplex ohne LIN54 rekonstituiert, das für die Erkennung der CHR-Sequenz erforderlich ist. Wir haben diesen MuvB-Subkomplexkern MuvB (MuvBcore) genannt. MuvBcore ist genauso stabil wie der gesamte MuvB-Komplex (Ergänzende Abbildungen 1a, b und 2a, b), was zeigt, dass das Fehlen von LIN54 die strukturelle Integrität von MuvB nicht beeinträchtigt. Wir haben diesen Komplex daher verwendet, um seine Wechselwirkung mit einem Modellnukleosom, das mit einer 167 Basenpaare (bp) langen DNA mit der 601-Widom-Sequenz rekonstituiert wurde, durch elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) zu untersuchen. Der MuvBcore-Komplex bindet das Nukleosom, wenn er in einem 4-fachen molaren Überschuss vorhanden ist (ergänzende Abbildung 2e). Erwartungsgemäß bindet dieser Komplex ein CHR-haltiges Nukleosom mit einer geringeren Affinität als der LIN54sh-haltige MuvB-Komplex (ergänzende Abbildung 2g). Wichtig ist, dass die Affinität von MuvBcore für ein Nukleosom höher ist als für freie DNA (ergänzende Abbildung 3a, b).

Um die Untereinheiten zu definieren, die direkt mit dem Nukleosom interagieren, und den Bindungsmodus des MuvB-Komplexes in Bezug auf das Nukleosom, haben wir versucht, einen MuvBcore:Nukleosom-Komplex wiederherzustellen, der für die Strukturanalyse mittels Kryo-EM geeignet ist. Der Nukleosomenkomplex mit MuvBcore: B-MYB (MMBcore) (ergänzende Abbildung 2f, Spuren 6–9) zeigte eine bessere Homogenität als Nukleosomenkomplexe mit MuvBcore (ergänzende Abbildung 2e, Spuren 1–5) und mit DREAMcore (ergänzende Abbildung 2f). , Spuren 1–5), wie von EMSA gezeigt (ergänzende Abbildung 2e, f). Tatsächlich ist die verschobene Bande von MMBcore: Nucleosome im Gegensatz zu den anderen getesteten Komplexen schärfer und definierter (ergänzende Abbildung 2e, f).

Um die Struktur des MMBcore:Nukleosom-Komplexes zu bestimmen (Abb. 1a), verwendeten wir das GraFix-Protokoll, um die Zerlegung während der Vitrifizierung zu minimieren (ergänzende Abb. 3c) und sammelten einen großen Datensatz auf einem Titan-Krios-Elektronenmikroskop, das mit einer Elektronenzählung ausgestattet war Direktdetektor (siehe „Methoden“, ergänzende Abbildung 4a). Durch eine umfassende zwei- und dreidimensionale Klassifizierung konnten wir die Gesamtstruktur des äußerst heterogenen und flexiblen MMBcore:Nukleosom-Komplexes aufklären (siehe „Methoden“, Ergänzende Abbildungen 4, 5 und Ergänzende Tabelle 1). Unsere Struktur zeigt, dass ein Teil von MMBcore, den wir MuvBTAIL nennen, mit dem Histonoktamer in Kontakt tritt und in die Nukleosomenscheibe eingebettet ist, während ein flexibel befestigtes Modul, das wir als MuvBHEAD bezeichnen, über die nukleosomale Eintritts-DNA reicht und an der Außenseite sitzt der DNA-Wirbel (Abb. 1b, c). Aufgrund der Flexibilität des Komplexes verwendeten wir gezielte Verfeinerungen, um die Strukturen von MuvBHEAD und MuvBTAIL mit einer Auflösung im Subnanometerbereich und die Struktur des Nukleosoms im Kontext des MMBcore:Nukleosom-Komplexes mit einer Auflösung von 3,3 Å aufzulösen (Ergänzungsfilm 1, Ergänzung). Abb. 5, Ergänzungstabelle 1 und „Methoden“).

Durch die Kombination unserer Kryo-EM-Rekonstruktionen des MMBcore:Nukleosom-Komplexes mit Daten der chemischen Vernetzungsmassenspektrometrie (XL-MS) und einer zusätzlichen hochauflösenden Kryo-EM-Struktur des MuvB-Apo-Komplexes, die wir erhalten haben (siehe unten und ergänzende Abbildungen). 6–9, Ergänzungstabelle 1 und Ergänzungsdaten 1) konnten wir die Gesamtarchitektur eines MuvB-Kernkomplexes mit dem Nukleosom definieren (Abb. 1). Bemerkenswerterweise zeigt unsere Struktur, dass das Nukleosom im MMBcore:Nukleosom-Komplex umgestaltet ist. Ungefähr 20 Basenpaare der nukleosomalen DNA werden aus ihrer ungestörten Konformation gebogen und zwischen den Modulen MuvBHEAD und MuvBTAIL gehalten (Abb. 1b, c).

Nachdem wir die Module MuvBHEAD und MuvBTAIL bei unserer Rekonstruktion des MMBcore:Nukleosom-Komplexes identifiziert hatten, versuchten wir, die detaillierte Struktur von MuvB zu bestimmen, um eine mechanistische Interpretation des nukleosomengebundenen Komplexes zu erleichtern. Massenphotometrische Messungen des gereinigten MuvB-Komplexes zeigen einen Hauptpeak bei etwa 176 kDa (ergänzende Abbildung 1b), was darauf hindeutet, dass die fünf MuvB-Untereinheiten in einer Stöchiometrie von 1:1:1:1:1 in diesem Komplex vorhanden sind. Interessanterweise weist ein kleiner Teil des Komplexes ein höheres Molekulargewicht auf, was darauf hindeutet, dass dieser Komplex Oligomere bilden könnte (ergänzende Abbildung 1b). Um dies weiter zu untersuchen, führten wir an diesem Komplex eine SEC gekoppelt mit Mehrwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) bei verschiedenen Konzentrationen durch. Diese Analyse zeigt, dass MuvB konzentrationsabhängig oligomerisieren kann (ergänzende Abbildung 1c). MuvB-Oligomere können durch kurze Inkubation des Komplexes mit Glutaraldehyd stabilisiert werden, wodurch sie als teilweise überlappende Peaks in SEC eluieren (ergänzende Abbildung 1a). Ein monomerer MuvB-Komplex kann durch SEC aus Oligomeren isoliert werden (ergänzende Abbildung 1a). Dieses Vernetzungsverfahren trug maßgeblich dazu bei, eine äußerst homogene Probe zu erhalten, die zur Herstellung von Kryo-EM-Gittern verwendet werden konnte (ergänzende Abbildung 7a). Wir haben daher eine 3D-Rekonstruktionskarte mit einer Auflösung von 3, 5 Å erhalten (Ergänzende Abbildungen 7–9). Die hervorragende Qualität der Kryo-EM-Karte (ergänzende Abbildungen 8 und 9) ermöglichte die Ab-initio-Erstellung eines Atommodells einer ~70-kDa-Struktur, die das WD40-Domänen enthaltende RbBP4, die Domäne im Rb-bezogenen Pfad (DIRP), berücksichtigt ) und die Tudor-Domäne von LIN9, die mittlere Domäne (MD) und eine prolinreiche Schleife (PRL) von LIN37 (Abb. 1a – c und 2a – d). Wir nennen diesen Teil von MuvB RbBP4-Subkomplex (Abb. 2a). Bemerkenswerterweise ist der Rest des MuvB-Komplexes in unserer Karte nicht sichtbar, was darauf hindeutet, dass diese Regionen des Komplexes im Hinblick auf den RbBP4-Subkomplex hoch mobil sind.

a–d Cartoon-Darstellung, die die Struktur des RbBP4-Subkomplexes zeigt. Die Lage dieses Komplexes im Verhältnis zum Gesamtmodell ist in (a, b) dargestellt. Blades der RbBP4-WD40-Domäne sind in (b) nummeriert. RbBP4 ist in c auf der Oberfläche dargestellt, um die erweiterte Interaktion der N-terminalen Domänen von LIN9 (DIRP und Tudor) und der prolinreichen Schleife (PRL) der mittleren Domäne von LIN37 hervorzuheben. e, f LIN37CTD verbindet den RbBP4-Komplex mit der nukleosomalen DNA (SHL −7).

Mit Ausnahme des LIN37-PRL stellen wir fest, dass unsere Ergebnisse, die unter Verwendung des vollständigen MuvB-Apo-Komplexes erzielt wurden, mit den Ergebnissen einer kürzlich durchgeführten kristallographischen Studie übereinstimmen, die die Struktur eines isolierten LIN9DIRP-Tudor-RbBP4-LIN37MD-Subkomplexes berichtet9. Der RMSD zwischen unserer Kryo-EM-Struktur und der veröffentlichten Kristallstruktur beträgt 0,658 Å.

In unserer Struktur interagiert die aminoterminale Region von LIN9, einschließlich DIRP und der Tudor-Domäne, intensiv mit RbBP4 an vier verschiedenen Stellen rund um die konservierte aminoterminale RbBP4-Helix α1 (Abb. 2b – d), die ein Protein-Protein-Zentrum darstellt Wechselwirkung in mehreren anderen RbBP4-haltigen Komplexen28,29,30. Diese Wechselwirkung vergräbt eine Gesamtoberfläche von 2809 Å2.

Die WD40-Domäne von RbBP4 besteht aus einem Propeller mit sieben Blättern und weist eine sogenannte „obere“ Seite auf, die weniger breit ist als die untere (Abb. 2b). Auf der Oberseite bilden die Rotorblätter eins und sieben einen ersten Patch für LIN9 α1 und 2, die etwa 90 Grad zueinander ausgerichtet sind (Abb. 1b, 2b – d und ergänzende Abb. 9b). Darüber hinaus packt LIN9 α2 die Amino-terminale Helix von RbBP4 (Abb. 1b, 2b – d und ergänzende Abb. 10c). LIN9 α3, 4 und 5 verstärken zusätzliche Wechselwirkungen mit dem carboxyterminalen Teil der RbBP4-Aminoterminalhelix, wo LIN9 die Unterseite der WD40-Domäne an Blatt 6 erreicht (Abb. 2c, d). Die Grundschleife nach Helix 5 besetzt die Histon-H4-Bindungsstelle von RbBP442, indem sie zwischen RbBP4 α1 und der PP-Schleife von Blatt 6 liegt (Abb. 2b, c). Konsequenterweise ist ein wiederhergestellter MuvB-Komplex nicht in der Lage, H4-Peptide zu binden9.

Die LIN9-Tudordomäne liegt zwischen LIN9 α3 und 6 und dem Beginn von RbBP4 α1 (Abb. 1b, 2b – d und ergänzende Abb. 9e). Die letztere Wechselwirkung wird durch RbBP4 Arg15 und Glu14 vermittelt, die mit den Paaren Tyr269-Glu270, Arg229-Arg231 interagieren, die aus der LIN9-Tudordomäne stammen (ergänzende Abbildung 9e). Ähnliche Argininpaare in Tandem-Tudor-Domänen sind an der DNA-Bindung beteiligt43. Da diese Argininreste stark mit RbBP4 interagieren, ist es unwahrscheinlich, dass die LIN9-Tudordomäne an der DNA-Bindung beteiligt ist. Darüber hinaus ist diese Domäne nicht an der Bindung von Histonpeptiden beteiligt9, was darauf hindeutet, dass die LIN9-Tudordomäne ausschließlich eine strukturelle Rolle beim Aufbau des RbBP4-Subkomplexes und keine Rekrutierungsrolle für DNA oder Histone spielt. Konsequenterweise befindet sich in unserer MMBcore:Nukleosomenstruktur die Tudordomäne weit entfernt von Histonen und DNA und stellt keinen offensichtlichen Kontakt mit diesen her (Abb. 1b).

LIN37MD wird von einer Helix gebildet, die eine konservierte PLYxCRxW-Sequenz trägt (Abb. 1b, 2a – d und ergänzende Abb. 9a – c, 10a). Diese Reste interagieren mit LIN9 α1 und 2 und mit der RbBP4-Insertionsschleife, die von Klinge 1 kommt (ergänzende Abbildung 9b, c). Darauf folgen eine kurze Schleife und ein kleines β-Faltblatt, die auf LIN9 α1 aufgesattelt werden (ergänzende Abbildung 9c). An dieser Wechselwirkung sind LIN37 Glu111 und LIN9 Arg108 sowie erweiterte hydrophobe Kontakte beteiligt (ergänzende Abbildung 9c).

Bemerkenswerterweise verbindet ein C-terminales PRL LIN37 mit LIN9 α4 und stützt so LIN9 in RbBP4 (ergänzende Abbildung 9a und Abbildungen 1a, c, 2c, d). Unsere Struktur legt nahe, dass LIN37 eine Schlüsselrolle bei der Stabilisierung des MuvB-Komplexes spielt und dass sich ohne LIN37 rekonstituiertes MuvB immer noch bilden kann, es ist jedoch weniger stabil, wie durch Massenphotometrie gezeigt (ergänzende Abbildung 2c, d). Dies steht im Einklang mit anderen Erkenntnissen, die zeigen, dass LIN37 für den MuvB-Zusammenbau nicht erforderlich ist,44 unsere Struktur-Funktionsanalyse zeigt jedoch darüber hinaus, dass es tatsächlich an der komplexen Stabilität beteiligt ist.

Unsere RbBP4-Subkomplexstruktur passt problemlos in das MuvBHEAD-Modul der MMBcore-Kryo-EM-Karte, wo sie den größten Teil dieser Kryo-EM-Dichte einnimmt (ergänzende Abbildungen 5a, c, d und ergänzender Film 1). Das Andocken ist eindeutig, da die in der Kryo-EM-Karte sichtbaren Sekundärstrukturen mit den Atomkoordinaten übereinstimmen (ergänzende Abbildung 5d und ergänzender Film 1). Die zusätzliche Dichte erstreckt sich von der PRL von LIN37 und konnte eindeutig dem konservierten LIN37CTD zugeordnet werden, das sich zu einer geknickten α-Helix faltet (Abb. 1b, c, ergänzende Abbildungen 5a, d, 10b und ergänzender Film 1). Diese Zuordnung steht im Einklang mit unseren XL-MS-Daten (ergänzende Abbildung 6c), in denen mehrere Vernetzungen zwischen LIN37CTD und LIN9 α5 und 6 beobachtet werden, was die Tatsache unterstützt, dass diese Teile des Komplexes nahe beieinander liegen.

LIN37CTD enthält viele basische Reste, die der nukleosomalen Eintritts-DNA der MMBcore:Nukleosom-Struktur zugewandt sind (Abb. 1b, c, 2e, f, 3a – c), was darauf hindeutet, dass diese Domäne an der Verankerung des MuvBHEAD an der Außenseite des Nukleosoms beteiligt ist Eintrag DNA. In Übereinstimmung damit bindet ein ohne LIN37CTD (ΔLIN37CTD-Mutante) rekonstituierter MuvBcore-Komplex das Nukleosom mit geringerer Affinität als der Kontroll-MuvBcore (Abb. 3f, Spuren 5–7 gegenüber 1–4).

a, b Nahaufnahme von a auf den V-förmigen Proteinkanal, der von B-MYBCTH:LIN9CC:LIN52CC und LIN37CTD gebildet wird. Der Übersichtlichkeit halber sind die LIN37CTD-Schleifen und der LIN9CTD nicht dargestellt. c Dieser Kanal, der basische Reste (angezeigt) enthält, die die Eintritts-DNA festklemmen, wird hier als elektrostatisches Oberflächenpotential dargestellt (−/+5.000). d, e Strukturbasierte Mutationsanalyse zur funktionellen Validierung von Wechselwirkungen zwischen LIN37, B-MYB und dem Nukleosom in EMSA. Entweder MuvBcore oder MMBcore, die LIN37 enthielten oder nicht (ΔLIN37) oder eine LIN37-NTD-Verkürzung (LIN37ΔNTD) enthielten, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, NCP 167 zu binden (in einem Molverhältnis von 1:1, 1:2, 1:4 NCP: MuvB). Quantifizierungen für d sind in (e) aufgetragen. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3) dargestellt. f MuvBcore, der FL-LIN37 oder seine NTD-Verkürzung (LIN37ΔNTD) oder seine CTD-Verkürzung (LIN37ΔCTD) enthielt, wurde wie in (d) getestet. Dieses Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. g–i-Sequenzausrichtung, die die Konservierung auf dem LIN37-NTD zeigt. Die in den Tests in h und i mutierte RRKKRR-Motivregion ist angegeben. h, i MuvBcore mit LIN37 oder LIN37 Arg-zu-Glu-Punktmutanten, d. K46A/K54A (NTD_RK) wurden wie in d entweder auf Nukleosom- (h) oder DNA-Bindung (i) untersucht. Diese Experimente wurden unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. j EMSAs mit NCP 167 und entweder MuvBcore oder MuvBHEAD-LIN37FL oder LIN9CC:LIN52 oder LIN9CC-CTD:LIN52, um die Fähigkeit von MuvBHEAD und MuvBTAIL zu testen, Nukleosomen zu binden. Die hier verwendeten Molverhältnisse waren 1:1, 1:2, 1:4 NCP:MuvB-Komplex. Dieses Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der RbBP4-Subkomplex an den RbBP4-Blade 1 und 6 gebildet wird, wo LIN9 DIRP und Tudor binden, und dieser Aufbau wird durch die mittlere Domäne von LIN37 und PRL stabilisiert (Abb. 1a und ergänzende Abb. 9a). Die Bindung an das Nukleosom stabilisiert LIN37CTD in Bezug auf den RbBP4-Subkomplex, der sich vom LIN37PRL bis zur äußeren Oberfläche der nukleosomalen Eintritts-DNA erstreckt (Abb. 1b) und so zur Nukleosomenbindung beiträgt.

Das MuvBTAIL-Modul ist auf der nukleosomalen Eintritts-DNA verankert, die sich in Richtung der Nukleosomalscheibe erstreckt (Abb. 1b, c). Bemerkenswerterweise bilden MuvBHEAD und MuvBTAIL einen V-förmigen Tunnel, der sich an der Eintritts-DNA festklammert (Abb. 1b, c, 3b, c und Zusatzfilm 1).

Der größte Teil des MuvBTAIL besteht aus dem LIN9-C-Terminus, einschließlich einer Coiled-Coil-Domäne, die mit der LIN52-Coiled-Coil-Domäne (im Folgenden als LIN9:52CC bezeichnet) und mit der C-terminalen Helix (CTH) von B-MYB interagiert. Die Struktur dieses MMB-Subkomplexes wurde zuvor durch Röntgenkristallographie gelöst und konnte eindeutig in unsere MuvBTAIL:Nucleosome-Kryo-EM-Rekonstruktion eingepasst werden (ergänzende Abbildungen 5a, b, f und ergänzender Film 1).

LIN9:52CC bindet die Eintritts-DNA an der superhelikalen Stelle (SHL) −8, die sich spätestens 10 Basenpaare an einem Ende des verwendeten 167 nukleosomalen DNA-Konstrukts befindet. Diese Wechselwirkung wird hauptsächlich durch B-MYBCTH vermittelt, das zwei zur DNA ausgerichtete Argininreste enthält (d. h. Arg672 und Arg682) (Abb. 1b, c und 3b, c). In Übereinstimmung damit bindet MMBcore das Nukleosom besser als MuvBcore (Abb. 3d, vergleiche Spuren 1–4 mit Spuren 8–10 und Abb. 3e).

Das grundlegende LIN37NTD weist mehrere Vernetzungen mit MuvBTAIL hauptsächlich am LIN9:52CC-Modul auf (ergänzende Abbildung 6c und Abbildung 3g), was darauf hindeutet, dass sich diese Region in der Nähe der nukleosomalen DNA befindet. Daher untersuchten wir, ob LIN37NTD zur Nukleosomenbindung beitragen könnte. Bemerkenswerterweise wird durch die Löschung dieses Teils von LIN37 die Bindung von MuvBcore an Nukleosomen aufgehoben (Abb. 3d, Spuren 1–7 und Abb. 3e und 3f, Spuren 1–4 gegenüber Spuren 8–10). Wichtig ist, dass die Löschung von LIN37NTD die strukturelle Stabilität und den Aufbau von MuvBcore nicht veränderte (ergänzende Abbildung 2h). Angesichts der auffälligen Wirkung dieser Mutation haben wir den Teil von LIN37NTD eingegrenzt, der zur Nukleosomenbindung beiträgt, und festgestellt, dass eine Sequenz, die ein RRKKRR-Motiv (Reste 64–78) enthält, von MuvBcore unbedingt benötigt wird, um sowohl das Nukleosom als auch die freie DNA zu binden (Abb . 3g–i, Spuren 1–7). Bemerkenswerterweise hat dasselbe Motiv in INCENP46 eine DNA-Bindungsfunktion.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der MMBcore-Komplex die nukleosomale Eintritts-DNA über einen durch MuvBHEAD und MuvBTAIL gebildeten Proteintunnel festklemmt (Abb. 1b, c und 3b, c), und die DNA-Bindung hängt hauptsächlich von LIN37 und B-MYB ab.

Wichtig ist, dass sowohl MuvBHEAD als auch MuvBTAIL für die volle Nukleosomenbindungsaktivität erforderlich sind. Tatsächlich sind das MuvBHEAD-LIN37NTD-Konstrukt sowie Konstrukte, die entweder einen LIN9CC:LIN52- oder einen LIN9CC-CTD:LIN52-Subkomplex enthalten, nicht in der Lage, das Nukleosom einzeln zu binden (Abb. 3j, Spuren 1–4 im Vergleich zu Spuren 5–13). ).

In unserer MMBcore:Nukleosom-Struktur wird das Nukleosom umgestaltet. Der Vergleich zwischen diesem Nukleosom und einer Apo-Nukleosom-Rekonstruktion, die aus unserem Kryo-EM-Datensatz durch 3D-Klassifizierung isoliert wurde (Abb. 4a – c und ergänzende Abb. 4c), zeigt, dass 20 Basenpaare der Eintritts-DNA (von SHL −6 bis SHL −). 8) werden um 50 Grad über der Nukleosomalscheibe gedreht und durch den MMBcore-Komplex in Position gehalten (Abb. 4a–d). Diese Eintritts-DNA wird an ihrem Ende etwa 25 Å nach oben angehoben, wie in unserer Dichte sichtbar. Darüber hinaus ist die Eintritts-DNA im Vergleich zu einem normalen Nukleosom nach innen gebogen (Abb. 4e). Bemerkenswerterweise verläuft die Dichte, die sich vom N-Terminus von LIN9CC aus erstreckt, unter der Eintritts-DNA, die sie verkeilt (ergänzende Abb. 5f und Abb. 1b, c), bevor sie zum LIN9-N-Terminus im MuvBHEAD-Modul weitergeht. Dies legt nahe, dass der MMB-Komplex die nukleosomale Austritts-DNA topologisch einschließt.

Die Dyadenansicht der MMBcore:NCP-Struktur ist in (b) dargestellt, farbcodiert wie in (a) angegeben. Der LIN9CTD wird nicht angezeigt, um die verzerrte nukleosomale DNA besser sichtbar zu machen. Die c-Kryo-EM-Dichte wird für den NCP-Komplex entweder im MMBcore:NCP (ergänzende Abbildung 5g) oder im Apo-NCP (ergänzende Abbildung 4c) angezeigt. Dieser Vergleich zeigt die Konformationsänderung an −/+7 SHL-Positionen. d–f Die DNA-Verzerrungen werden im Detail mit verschiedenen Ansichten des NCP-Modells (DNA in Oberflächendarstellung) aus der MMBcore:NCP-Struktur visualisiert, die einem Apo-NCP-Modell (DNA in Banddarstellung) überlagert ist. g MNase-Verdauungsprofil von NCP167 in Abwesenheit und Anwesenheit von MMBcore. Dieses Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. h Cartoon-Illustration des Nukleosom:H1-Komplexes (PDB-ID: 5Nl0) i EMSA-Experiment zeigt, dass die H1-Titration die NCP-Assoziation mit dem MMBcore verringert. Dieses Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Andererseits sind ~10 Basenpaare der Ausgangs-DNA bei SHL +7 in unserem Komplex nicht sichtbar (Abb. 4f), was darauf hinweist, dass dieser DNA-Abschnitt ungeordnet ist. Interessanterweise wird das Entpacken bei SHL +7 auch in Strukturen von ATP-abhängigen Chromatin-Remodelling-Komplexen mit dem Nukleosom beobachtet47,48.

Von 167 bp sind in unserer MMBcore:Nukleosomenstruktur nur 147 bp sichtbar. In Übereinstimmung damit zeigt der MNase-Verdauungstest des Nukleosoms in Gegenwart von MMBcore die Stabilisierung eines 147-bp-Fragments (Abb. 4g).

Ein Strukturvergleich des MMBcore:Nukleosom-Komplexes mit dem Histon H1:Nukleosom-Komplex49 zeigt, dass die gleichzeitige Bindung von MMB und H1 an dasselbe Nukleosom inkompatibel wäre (Abb. 5e und h). Dies liegt erstens daran, dass MuvBHEAD ähnlich wie das Linker-H1-Histon in der Nähe der Nukleosomen-Dyade lokalisiert ist (Abb. 4b, h); Zweitens ist der Weg der Austritts-DNA im MMBcore:Nukleosomen-Komplex stark umgeordnet und nicht mit der Bildung eines H1:Nukleosomen-Komplexes kompatibel (Abb. 4d, e und h). In Übereinstimmung damit verringert das Hinzufügen von H1 zu einem MMBcore:Nukleosom-Komplex die Menge an MMBcore:Nukleosom, während sich der H1:Nukleosom-Komplex bildet (Abb. 4i).

Die letzte Helix von LIN9 (α12) interagiert mit dem sauren Nukleosomenfleck und dem Histon H4. Eine vergrößerte Ansicht von a ist in (b) dargestellt. Obwohl die Auflösung unserer Strukturdaten in diesem Bereich die Auflösung von Seitenketten nicht zulässt, sind mögliche Seitenkettenwechselwirkungen zwischen der C-terminalen NRD-Sequenz von LIN9 und Resten von H2A- und H2B-Histonen (saure Reste sind Teil des sauren Nukleosomenflecks) möglich. und H4 werden basierend auf dem Andocken von Sekundärstrukturelementen in der NCP:LIN9CTD-Karte (ergänzende Abbildung 5f, h) modelliert und hier dargestellt. c LANA-Peptid konkurriert mit MuvB um die Bindung des Nukleosoms. Ein Komplex von MuvB mit einem Nukleosom, das eine CHR-Sequenz enthielt, wurde in einem EMSA entweder in Abwesenheit oder in Anwesenheit steigender Konzentrationen von LANA-Peptid getestet. Dieses Experiment wurde unabhängig voneinander dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. d Modellierung eines MMB-FOXM1:Nukleosom-Komplexes. Das AlphaFold-Modell aus der ergänzenden Abbildung 6d wurde dem LIN9CTD überlagert. Die Wechselwirkung mit dem CHR-Element wurde modelliert, indem die DNA aus PDB-ID: 5FD3 in die SHL-8-Region unseres MMBcore:Nukleosom-Komplexes überlagert wurde. FOXM1 wurde modelliert, indem die DNA von PDB-ID: 7FJ2 in die SHL-7-Region unseres MMBcore:Nukleosom-Komplexes überlagert wurde. Die Positionierung von FOXM1 an der Eintritts-DNA wird durch nukleosomale Bindungspräferenzen von FOX-TFs im Zusammenhang mit FOXM167 nahegelegt. e Schematische Darstellung des Komplexes in (d). Proteinschleifen in a und d sind ausgeblendet, um die Komplexität der Darstellung zu reduzieren. e, f Dargestellt ist ein Modell der Pionier-Transkriptionsfaktorfunktion des MMB-Komplexes. CHR-Stellen befinden sich direkt stromaufwärts eines Nukleosoms und werden als Teile von Nukleosomen-depletierten Regionen (Nucleosome Depleted Regions, NDRs)7,68 freigelegt. Während der S-Phase, wenn sich MMB bildet, würde die Umgestaltung eines Nukleosoms durch die Pionier-Transkriptionsfaktorfunktion von MMB die Freilegung von cis-wirkenden Sequenzen, einschließlich des TSS, ermöglichen. Dies würde den Aufbau einer Kompetenz für die Transkriptionsaktivierung an Genen des Zellzyklus ermöglichen. In Kombination mit der Rekrutierung nachgeschalteter Faktoren und ATP-abhängiger Chromatin-Remodellierer könnte dies die Bildung des Präinitiationskomplexes (PIC) und die Rekrutierung der RNA-Polymerase fördern. MMB kann auch an Promotor-Enhancer-Interaktionen teilnehmen56,57. Die vollständige Aktivierung der G2/M-Gene ist ein sehr komplexer Prozess, der posttranslationale Modifikationen sowohl an B-MYB als auch an FOXM120,27 erfordert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der MMBcore-Komplex die Eintritts-DNA bindet und sie dadurch verzerrt, was zur Freilegung von etwa 10 Basenpaaren nukleosomaler DNA an und unter den +/–7 SHL-Positionen führt. Wir gehen davon aus, dass diese freigelegte DNA für nachgeschaltete TFs zugänglich sein und auch den Aufbau der Transkriptionsmaschinerie erleichtern kann, wie weiter unten erläutert.

Es wurde gezeigt, dass RbBP4, wenn es an LIN9 und LIN37 gebunden ist, in der Lage ist, den H3-Histonschwanz zu binden9. In unserer Struktur befindet sich RbBP4 in der Nähe des Histon-H3-Schwanzes (Abb. 1c), was darauf hinweist, dass der Bindungsmodus von MMB mit dem Nukleosom Wechselwirkungen zwischen RbBP4 und dem H3-Schwanz ermöglichen würde. Unsere Kryo-EM-Daten lösen eine solche Wechselwirkung jedoch nicht direkt auf. Im Allgemeinen sind Histonschwänze für die Bildung des MuvBcore:Nukleosomenkomplexes nicht erforderlich (ergänzende Abbildung 3d). Außerdem können wir beim Hinzufügen der H3K4me3-Modifikation, die bei MuvB-Zielpromotoren vorhanden ist, keine Auswirkung auf die Bildung des MuvBcore:Nukleosomenkomplexes feststellen (ergänzende Abbildung 3e).

Andererseits zeigen unsere Kryo-EM-Karten die Dichte des konservierten LIN9CTD, das aus dem C-terminalen Ende der LIN9CC-Domäne hervorgeht (Ergänzende Abbildungen 5f, h, 10d, Abb. 1b, c und Zusatzfilm 1). Diese Domäne besteht aus einem 4-Helix-Bündel, wobei sich die längste C-terminale Helix (α12) auf die Nukleosomenscheibe erstreckt, bis ihr eigentlicher C-Terminus an den sauren Nukleosomenfleck und das benachbarte H4-Histon andockt (Abb. 5a, b). Konsequenterweise können steigende Konzentrationen des sauren Patch-Binder-LANA-Peptids50 mit MuvB um die Nukleosomenbindung konkurrieren, selbst in Gegenwart des CHR-Elements (Abb. 5c).

Darüber hinaus legen unsere Vernetzungsdaten nahe, dass LIN9CTD mit LIN54CTD interagiert (Abb. 1a und ergänzende Abb. 6d). Wir haben AlphaFold51 zur Modellierung dieser Wechselwirkung verwendet (ergänzende Abbildung 6d – f) und so ein vollständiges Modell des gesamten MMB:Nukleosomen-Komplexes erhalten (Abb. 5d). Diese Modellierungsübung legt nahe, dass LIN54CTD möglicherweise einen Hohlraum zwischen LIN9CTD, LIN9:52CC und der DNA einnimmt. Diese Anordnung würde die DNA-Bindungsdomänen von LIN54 in der Nähe eines CHR-Elements am SHL −8 des Nukleosoms platzieren (Abb. 1a und 5d). LIN54sh vernetzt sich mit allen anderen MuvB-Untereinheiten (ergänzende Abbildung 6e) und unterstützt so unsere Modellierung, dass LIN54 im Zentrum von MuvB zwischen TAIL- und HEAD-Modulen vorhanden ist.

Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass LIN9CTD eine kritische Komponente des MMB-Komplexes ist, der MuvB über die Rekrutierung von LIN54 direkt mit dem sauren Nukleosomenpflaster und mit dem CHR verbindet.

Unsere Kryo-EM-Struktur zeigt, dass der MMB-Komplex aus zwei Hauptmodulen besteht, hier MuvBHEAD und MuvBTAIL genannt. Diese beiden Module sind durch das Hauptgerüstprotein des Komplexes LIN9 flexibel verbunden (Abb. 1b, c und Zusatzfilm 1). LIN9 orchestriert den Aufbau von MuvBHEAD über seine N-terminalen DIRP- und Tudor-Domänen und den Aufbau von MuvBTAIL über seine C-terminale Coiled-Coiled-Domäne, die LIN52CC und B-MYBCTH rekrutiert. LIN9 rekrutiert zusammen mit RbBP4 LIN37 über seine mittlere Domäne am MuvBHEAD. LIN37 ist ein stabilisierender Faktor, da es LIN9 auf RbBP4 stützt. Außerdem zeigen wir, dass LIN37 im MuvB-Komplex ein DNA-bindendes Protein ist. Die LIN37-Termini sind für die vollständige Nukleosomenbindungsfähigkeit des MuvB-Komplexes unerlässlich. Bemerkenswerterweise verlieren diese Regionen in Gegenwart von B-MYB an Bedeutung für die Nukleosomenbindung. Tatsächlich kann der MMBcore-Komplex auch in Abwesenheit von LIN37 immer noch ein Nukleosom binden (Abb. 3d). Unsere Struktur zeigt eine Erklärung dafür. Von LIN9:52CC rekrutiertes B-MYBCTH kontaktiert direkt die Eintritts-DNA stromaufwärts von LIN37 (Abb. 1b, 3b, c und Zusatzfilm 1). Dies steht im Einklang mit früheren Daten, die zeigen, dass der C-Terminus von B-MYB für die B-MYB-abhängige Transkriptionsaktivierung ausreicht52,53 und dass LIN37 für die Transkriptionsaktivierungsfunktionen von MuvB entbehrlich ist44,54.

Unser MMB:Nukleosom-Komplex zeigt auch, dass MMB das Nukleosom mit einer 1:1-Stöchiometrie bindet und den Chromatin-Remodelling initiiert, was ein funktionelles Merkmal von Pionier-TFs ist. Durch das Klemmen der Eintritts-DNA hebt MMB 20 Basenpaare an und legt so die DNA bei SHL −7 frei. Die der Verzerrung folgende DNA ist in anderen Pionier-TFs-Komplexstrukturen nicht sichtbar34,35. In unserer Struktur ist dieser Bereich sichtbar, weil er durch den MMB-Komplex selbst eingeklemmt wird.

Wie gelingt dieser Umbau? Eine solche Konformationsänderung erfordert eine Unterbrechung der Wechselwirkungen zwischen Histon H3 und SHL −7 (Abb. 4d). Ähnlich wie bei anderen Pionier-TFs kann im Fall von MMB die Störung der Histon-DNA-Wechselwirkungen durch die Bindungsenergie zwischen MMB und der nukleosomalen DNA kompensiert werden. Darüber hinaus ist RbBP4 stark negativ geladen und befindet sich in der Nähe von SHL −6 (Abb. 4b), wo die DNA-Verzerrung beginnt. Auf dieser Grundlage entsteht eine interessante Hypothese, wonach ein Ladungsabstoßungsmechanismus zwischen RbBP4 und der DNA bei SHL −7 zur Abweichung des DNA-Pfades beitragen könnte. Dies könnte auch die hohe Mobilität von MuvBHEAD in Bezug auf das Nukleosom erklären, wie in unseren Kryo-EM-Daten beobachtet (ergänzende Abbildung 4f). Darüber hinaus beobachten wir eine Dichte, die vom LIN9CC-N-Terminus in Richtung MuvBHEAD kommt (Abb. 1c und ergänzende Abb. 5f). Dies legt nahe, dass MMB die Eintritts-DNA topologisch einschließt und so dazu beiträgt, die DNA in Position zu halten.

Die Konformation der Eintritts-/Austritts-DNA in unserer MMB:Nukleosom-Komplexstruktur wäre nicht mit der Linker-Histon-H1-Bindung kompatibel. Wir zeigen konsistent, dass H1 mit MMB vom Nukleosom konkurrieren kann (Abb. 4e und 4h, i). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass CHR-haltige Regionen typische Merkmale aktiv transkribierender Gene12 und nicht von Heterochromatinregionen aufweisen, die mit H155 angereichert sind.

Wichtig ist, dass LIN54 und die MuvB-Ziel-CHR-Sequenz nicht in unserer MMB:Nukleosomenstruktur enthalten sind, was darauf hinweist, dass die nukleosomenabhängige Umgestaltung durch den MMB-Komplex unabhängig von der CHR-Erkennung ist und die Umgestaltung daher eine intrinsische Eigenschaft des Kern-MMB-Komplexes wäre. Darüber hinaus beobachten wir, dass die letzte Helix von LIN9 in den sauren Bereich des Nukleosoms eingefügt wird (Abb. 5a, b). Dies legt nahe, dass eine direkte Wechselwirkung des MMB-Komplexes mit dem Nukleosom zur Verankerung und Positionierung des Komplexes auf dem Nukleosom beiträgt. Die Fähigkeit, sowohl nukleosomale DNA als auch das Histon-Octamer zu binden, könnte erklären, warum MuvB Nukleosomen stabilisiert9.

Unter Berücksichtigung früherer und aktueller Arbeiten schlagen wir ein Modell der MMB-Funktion als Pionier-TF-Komplex vor (Abb. 5d – f). MuvB, das beim G1/S-Phasenübergang aus DREAM zerlegt wurde, setzt sich mit B-MYB zusammen und bildet so den MMB-Komplex (Abb. 5d, e). Der MMB-Komplex befindet sich an CHR-DNA-Elementen in der Nähe des TSS und des +1-Nukleosoms. Dieses Nukleosom wird durch MMB umgestaltet, wodurch DNA an −/+7 SHL-Positionen freigelegt wird (Abb. 5d, e).

Dies würde die Rekrutierung nachgeschalteter Transkriptionsfaktoren (z. B. FOXM1)20 und den Aufbau der basalen Transkriptionsmaschinerie am TSS erleichtern. Es wurde gezeigt, dass MMB an Wechselwirkungen zwischen den basalen Promotor- und Enhancer-Elementen56,57 beteiligt ist, was die Bedeutung dieses Komplexes für die Transkriptionsaktivierung mitotischer Gene untermauert.

Zusammenfassend liefert unsere Struktur-Funktions-Untersuchung des MuvB-Komplexes Einblicke in den komplexen Aufbau, die Wechselwirkungen und den Bindungsmodus mit einem Nukleosom. Unsere Studie ebnet den Weg für die Untersuchung eines mechanistischen Modells der MuvB-Funktion bei der Transkriptionsaktivierung und der B-MYB-vermittelten Onkogenese.

Die Codon-optimierten Kodierungssequenzen (CDSs) des Wildtyps, der Verkürzungen und der Punktmutanten menschlicher MuvB- und B-MYB-Proteine ​​wurden von Genscript oder GeneArt (Thermo Fischer Scientific) erhalten und in den pFASTBAC-1- oder pACEBAC-1-Vektor kloniert mit Standardmethoden. Konstruktgrenzen sind wie folgt: LIN9FL(1–542), LIN9MuvB(HEAD)(94–278), LIN9CC(325–450), LIN9CC-CTD(332–542), LIN37FL(1–246), LIN37ΔNTD(92– 246), LIN37ΔCTD(1–132), RbBP4FL(1–425), LIN52FL(1–116), LIN54CTD(635–749), LIN54short(515–749), B-MYBFL(1–700).

Punktmutanten in LIN37FL: LIN37RRKKRR(R64E/R68E/R73E/R74E/R77E/R78E), LIN37NTD_R(R19E/R37E), LIN37NTD_RK(R19E/R37E/K5A/K7A/K10A/K32A/K46A/K54A). Für die Expression und den Zusammenbau des MuvB-Komplexes wurden Hi-5-Zellen mit einer Dichte von 1,5 × 106 Zellen ml-1 mit Vorkulturen von Sf9-Zellen koinfiziert, die jeweils mit rekombinanten MuvB-Baculoviren vorinfiziert waren. Die Zellen wurden mit einer Lebensfähigkeit von ca. 85 % geerntet, was typischerweise ca. 2 Stunden dauerte. 48 h und bis zur Verarbeitung bei −80 °C gelagert. B-MYB-Protein wurde auf ähnliche Weise wie MuvB separat exprimiert.

Hi-5-Zellen, die MuvB-(Sub-)Komplexe (Wildtyp oder Mutanten) exprimieren, wurden in Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris pH8, 300 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5 % Glycerin, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 2 mM enthielt Benzamidin, 5 U ml−1 Benzonase (Novagen), komplette EDTA-freie Proteaseinhibitoren (Roche) und durch Ultraschallbehandlung und anschließende Zentrifugation lysiert. Die gefilterte lösliche Fraktion des Lysats wurde zur Reinigung unter Verwendung des StrepIIx2-Tags auf LIN37 oder RbBP4 (letzteres auf dem MuvB-ΔLIN37-Komplex) auf eine Strep-Tactin Superflow-Säule (30060, Qiagen) geladen. Gebundenes Protein wurde mit 20 CV mit Puffer gewaschen, der 50 mM Tris pH8, 300 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5 % Glycerin enthielt, gefolgt von einem Waschen mit 4 CV 50 mM Tris pH8, 1000 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5 % Glycerin und anschließend mit Puffer eluiert, der 50 mM Tris pH8, 300 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5 % Glycerin und 2,5 mM d-Desthiobiotin enthält. Der Strep-Tag wurde durch eine Inkubation bei 4 °C über Nacht mit 3 °C Protease entfernt. Die endgültige Politur wurde durch SEC auf einer S200- oder Superose 6-Säule (GE Healthcare) in Puffer mit 20 mM HEPES pH 8, 150 mM NaCl und 0,5 mM TCEP erreicht. Peak-Fraktionen wurden gepoolt und auf bis zu 5 mg/ml konzentriert.

B-MYB-Protein wurde separat gemäß obigem Protokoll gereinigt. Für den MMB-Komplexaufbau wurden frisch hergestellte MuvB:B-MYB-Proteine ​​im Verhältnis 1:4 gemischt und 1 Stunde lang auf Eis inkubiert, gefolgt von SEC auf einer Superose 6-Säule in Puffer mit 20 mM HEPES pH 8, 100 mM NaCl, 0,2 mM TCEP.

Rekombinantes H1 mit N-terminalem Hexahistidin-Tag und C-terminalem StrepIIx2-Tag wurde in Escherichia coli exprimiert. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 0,5 mM IPTG induziert, als die OD600 0,7 erreichte, und über Nacht bei 18 °C fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert. Das H1-Protein wurde mit Strep-Tactin Superflow Plus (QIAGEN) und HiTrap Heparin HP (GE Healthcare) gemäß dem Standardprotokoll gereinigt. Sowohl N-terminale als auch C-terminale Tags wurden durch 3C-Protease-Verdau über Nacht entfernt. Unmarkiertes H1-Protein wurde auf eine S200 16/600-Säule (GE Healthcare) geleitet. Reine H1-Fraktionen wurden konzentriert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur späteren Verwendung bei –80 °C gelagert.

Rekombinante menschliche Histone H2A, H3, H4 und Xenopus laevis H2B wurden separat in Escherichia coli überexprimiert, von Einschlusskörperchen gereinigt und wie zuvor beschrieben zu einem Histon-Octamer zusammengesetzt58. Kurz gesagt, die Einschlusskörper für jedes Histon wurden einzeln in harnstoffhaltigem Puffer aufgelöst und durch eine Ionenaustauschsäule weiter gereinigt. Denaturierte Histone wurden in einem H2A:H2B:H3:H4-Molverhältnis von 1,2:1,2:1:1 gemischt und gegen Rückfaltungspuffer dialysiert, der 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA und 10 mM β enthielt -Mercaptoethanol. Neugefaltetes Histonoctamer wurde von Aggregaten und überschüssigem H2A-H2B-Dimer durch Gelfiltration auf einer S200 16/600-Säule (GE Healthcare) gereinigt, die im gleichen Rückfaltungspuffer betrieben wurde. Reine Histon-Octamer-Fraktionen wurden konzentriert, auf eine endgültige Glycerinkonzentration von 50 % (v/v) gemischt und zur späteren Verwendung bei –20 °C gelagert.

Nukleosomale DNA wurde mit dem Plasmid Giga Kit (QIAGEN) hergestellt. Plasmid mit vier Wiederholungen der 167-bp-Sequenz (TAC CCG GGA TAT CGA GAA TCC CGG TGC CGA GGC CGC TCA ATT GGT CGT AGA CAG CTC TAG CAC CGC TTA AAC GCA CGT ACG CGC TGT CCC CCG CGT TTT AAC CGC CAA GGG GAT TAC TCC CTA GTC TCC AGG CAC GTG TCA GAT ATA TAC ATC CGA TAT CCC GGG TA) wurde in XL10-Gold-Bakterien transformiert. Die Zellen wurden über Nacht gezüchtet und die Plasmidextraktion erfolgte gemäß dem QIAGEN Plasmid Giga Kit-Protokoll. Das extrahierte Plasmid wurde über Nacht mit BstZ17I (NEB) verdaut. Die 167 bp große nukleosomale DNA wurde mittels einer Ionenaustauschsäule von der Vektor-DNA gereinigt. Spurenmengen von BstZ17I wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion inaktiviert.

Nukleosomale DNA, die die CHR-Sequenz enthielt, wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt. Die PCR wurde gemäß dem Standardprotokoll unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase mit ThermoPol®-Puffer (NEB) durchgeführt. Als Matrize wurde die Widom 601-Sequenz verwendet und die PCR-Reaktion auf ein Reaktionsvolumen von 20 ml vergrößert. Das PCR-Produkt wurde mit der HiTrap Q HP-Anionenaustauschsäule (GE Healthcare) gereinigt. Fraktionen, die reine nukleosomale DNA enthielten, wurden gepoolt, mit Ethanol gefällt, in Wasser gelöst und schließlich zur späteren Verwendung bei –20 °C gelagert. Die Sequenz der nukleosomalen DNA mit der CHR-Sequenz ist GAG TTC AAA ATC GAG AAT CCC GGT GCC GAG GCC GCT CAA TTG GTC GTA GAC AGC TCT AGC ACC GCT TAA ACG CAC GTA CGC GCT GTC CCC CGC GTT TTA ACC GCC AAG GGG ATT ACT CCC TAG TCT CCA GGC ACG TGT CAG ATA TAT ACA TCC GAT.

Die Rekonstitution des Nukleosoms (NCP167 und NCP mit der CHR-Sequenz) wurde wie zuvor beschrieben58 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, Histonoktamer und nukleosomale DNA wurden im Verhältnis 1,1:1 in einem Rekonstitutionspuffer mit hohem Salzgehalt gemischt, der 2 M NaCl, 20 mM HEPES pH 7,5, 5 mM DTT und 1 mM EDTA enthielt. Die Probe wurde in einen Dialyseknopf (Hampton Research) überführt und der Knopf in ein Becherglas gegeben, das denselben Rekonstitutionspuffer mit hohem Salzgehalt enthielt. Salzarmer Rekonstitutionspuffer mit 20 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,5, 5 mM DTT und 1 mM EDTA wurde langsam in den Dialysebecher gepumpt, um die Salzkonzentration allmählich zu reduzieren und die NCP-Bildung zu ermöglichen. Die Probe wurde nach 24 Stunden in einen frischen Rekonstitutionspuffer mit niedrigem Salzgehalt überführt und 4 Stunden lang weiter äquilibriert. Lösliches NCP167 wurde durch Zentrifugation von Aggregaten getrennt und zur späteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

Der NCP167 mit der H3K4me3-Modifikation wurde von ActiveMotif erworben.

Rekonstituiertes NCP167 wurde in Verdauungspuffer, der 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM NaCl und 1 mM TCEP enthielt, auf eine Endkonzentration von 1,8 μM verdünnt. Auf Magnetkügelchen (Takara) immobilisiertes TPCK-Trypsin wurde gewaschen und im gleichen Verdauungspuffer äquilibriert und mit NCP167 im Volumenverhältnis 1:1 gemischt. Die Verdauung wurde nach 20, 40, 60 und 80 Minuten durch Entfernen des mit Magnetkügelchen gekoppelten Trypsins aus der Lösung gestoppt. Alle Proben wurden auf SDS-PAGE getestet, um den Abschluss der Entfernung der Histonschwänze zu beurteilen.

Das NCP wurde mit MMBcore in einer Konzentration von 0,6 bzw. 1,8 μM gemischt und mit EMSA-Puffer, der 20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl und 0,5 mM TCEP enthielt, auf ein Endvolumen von 10 μL aufgefüllt. Als Kontrolle wurde auch separat eine Reaktion hergestellt, die nur NCP enthielt. Zu jeder Probe wurde MNase-Reaktionspuffer (NEB) in einer Endkonzentration von 1x hinzugefügt. Anschließend wurden jeder Probe 2,5 μl 1000 Einheiten/μl MNase (NEB) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Von jeder Probe wurden 30 s, 1 min und 1,5 min nach der MNase-Zugabe 3 μl aliquotiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer Proteinase-K-Lösung (ThermoFisher Scientific) zu jedem Aliquot beendet. Die Proben wurden auf NovexTM 4–12 % FSME-Gel (ThermoFisher) analysiert. Die Gele wurden mit SYBR Safe gefärbt und mit dem Typhoon FLA 9500 Imager gescannt.

Die analytische SEC-Kopplung mit Mehrwinkel-Laserlichtstreuung (MALS) wurde auf einem Agilent 1260 Infinity II HPLC-System durchgeführt. Lichtstreuungs- und Differentialbrechungsindexprofile (dRI) der Proben wurden inline mit den Instrumenten DAWN und Optilab von Wyatt Technologies analysiert. Proben des gereinigten MuvB-Komplexes in verschiedenen Konzentrationen (20 μl Volumen) wurden auf eine Superose 6 3,2/300-Säule (GE Healthcare) aufgetragen, die mit 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM TCEP mit einer Flussrate von 0,05 ml/äquilibriert war. Mindest. Die Daten wurden gemäß dem Zimm-Lichtstreuungsmodell und einem dn/dc von 0,185 ml/g mit der Software ASTRA 7.3.1 (Wyatt) analysiert.

Massenphotometrie-Experimente wurden mit einem Refeyn OneMP-Massenphotometer (Refeyn Ltd, Oxford, UK) wie zuvor beschrieben durchgeführt59. Mikroskopdeckgläser (630-2187, VWR) und CultureWell™-Dichtungen aus Silikon (GBL103250, Sigma-Aldrich) wurden mit 100 % Isopropanol und Wasser gereinigt und mit Druckluft getrocknet. Die Dichtungen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die gereinigten Deckgläser auf dem Probentisch des Massenphotometers gelegt.

Alle Messungen wurden mindestens fünfmal unabhängig voneinander in separaten Vertiefungen in Puffer mit 20 mM HEPES pH 8, 150 mM NaCl und 0,5 mM TCEP durchgeführt. Zunächst wurden 12 μL Puffer in eine Dichtungsmulde pipettiert, gefolgt von der Fokuspunkterfassung mithilfe der Autofokusfunktion in der Refeyn AcquireMP 2.3.1-Software. Zweitens wurden 2 μl 500 nM MuvB-Komplexe (unmittelbar vor der Messung auf diese Konzentration verdünnt, um eine komplexe Zerlegung zu vermeiden) in die pufferhaltige Dichtungsvertiefung pipettiert und gemischt, um einzelne Landeereignisse unterhalb des Sättigungsniveaus zu beobachten. Massenphotometriefilme mit 6000 Bildern wurden aus einem Sichtfeld des Instruments mit 10,8 × 10,8 μm aufgenommen. Die Daten wurden mithilfe der Standardpipeline der Refeyn DiscoverMP 2.3.0-Software verarbeitet. Einzelne Partikelkontraste aus jedem Video wurden mithilfe einer Kontrast-zu-Masse-Kalibrierung (C2M), die im Erfassungspuffer durchgeführt wurde, in Masse umgewandelt. Die Daten wurden als normalisierte Histogramme mit einer Klassenbreite von 4,4 dargestellt und an einen Gaußschen Peak angepasst. Für die Kalibrierung wurden 2 μl eines 1:100 vorverdünnten ungefärbten NativeMark-Proteinstandards (LC0725, Thermo Scientific) in eine Aufnahmevertiefung gegeben; Die Massen 66, 146, 480, 1048 kDa wurden für eine Standardkalibrierungskurve in der DiscoverMP-Software verwendet.

30 μl frisch gereinigter MuvB-Komplex in einer Konzentration von 28 μM wurden mit 0,1 μl 25 % Glutaraldehyd (G5882, Sigma-Aldrich) 2 Minuten lang auf Eis inkubiert, gefolgt von einem Abschrecken mit 2 μl 500 mM Tris pH8 und sofortiger SEC auf einem Superose 6 3,2/300-Säule (GE Healthcare) in Puffer mit 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 0,2 mM TCEP. Eluierte Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und MuvB-Monomer enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und auf 20 μl konzentriert und wie oben beschrieben erneut auf die SEC-Säule injiziert, um etwaige Verunreinigungen höherer Ordnung zu entfernen. Die Monomere enthaltende Fraktion wurde sofort für die Kryo-EM-Gittervorbereitung verwendet.

NCP167 und MMBcore wurden im Molverhältnis 1:2,5 gemischt und mindestens 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. GraFix wurde wie zuvor beschrieben41 durchgeführt. Mit einem Gradient Master (Biocomp) wurde ein kontinuierlicher Gradient mit 20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM TCEP, 10–30 % Saccharose und 0–0,1 % Glutaraldehyd erzeugt. Die Proben wurden unter Verwendung eines SW60 Ti-Ultrazentrifugenrotors bei 165, 100 × g 16 Stunden lang bei 4 ° C zentrifugiert. Die Proben wurden manuell fraktioniert und die Vernetzung durch Zugabe von Tris-HCl pH 7,5 bis zu einer Endkonzentration von 35 mM beendet. GraFix-Fraktionen wurden auf einer 5 %igen nativen PAGE analysiert, und diejenigen, die den vernetzten NCP167-MMBcore-Komplex enthielten, wurden konzentriert und der Puffer gegen 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM TCEP ausgetauscht.

2 μl des vernetzten monomeren MuvB-Komplexes wurden auf Quantifoil R1.2/1.3 Cu 300-Gitter aufgetragen, die mit Easiglow (Pelco) 1 Minute lang bei 15 mA glimmentladen wurden. Nach dem Auftragen der Probe wurden die Gitter sofort 5 Sekunden lang bei 4 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit abgetupft und unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher) in flüssiges Ethan getaucht.

2 μl der mit GraFix behandelten Probe wurden auf Quantifoil R1.2/1.3 Cu 300-Gitter aufgetragen, die mit Easiglow (Pelco) 1 Minute lang bei 15 mA glimmentladen wurden. Die Gitter wurden 5 s lang inkubiert und dann 5 s lang bei 4 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit geblottet (Blot-Stärke 3) und unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher) in flüssiges Ethan getaucht.

Wir haben 10.183 Filmstapel im EER-Format auf einem Glacios (Thermo Fisher) Cryo-TEM 200 kV, ausgestattet mit einem Falcon 4-Detektor, am ICR, bei einer Nennvergrößerung von 240.000 gesammelt, was eine Pixelgröße von 0,567 Å pro Pixel ergab. Diese Filme wurden während der Sammlung mit dem Live-Programm cryoSPARC60 live verarbeitet.

Filmstapel wurden viermal an Frames ausgerichtet und gruppiert, was eine Pixelgröße von 2,268 Å pro Pixel ergab. 8820 Bilder mit einer Auflösung von besser als 6 Å und einer Gesamtbewegung von 30 Pixeln (geschätzt bei der Bildausrichtung) wurden für die weitere Verarbeitung ausgewählt. Zur anfänglichen Partikelauswahl während der Live-Verarbeitung und zum Erhalten erster 2D-Klassendurchschnitte wurde ein Blob-Picker verwendet. Daraus generierte Vorlagen wurden für die Vorlagenauswahl und das TOPAZ61-Training und die Auswahl mit cryoSPARC verwendet. Insgesamt wurden 1.184.371 Partikel aufgenommen; Duplizierte Partikel wurden mithilfe der in cryoSPARC implementierten Funktion „Duplikate entfernen“ entfernt. Dieser Schritt entfernte doppelt ausgewählte Partikel innerhalb von 60 Å (die kürzeste Abmessung der MuvB-Partikel beträgt ~50 Å). Diese Partikel wurden mit einem weiteren 2D-Klassifizierungsschritt weiter gereinigt (ergänzende Abbildung 7). Diese Partikel wurden in die in cryoSPARC implementierte Funktion „Ab-initio-Modell“ weitergeleitet. Um die Partikelsortierung im Prozess zu ermöglichen, wurden drei Klassen verwendet. Dadurch entstand eine Klasse mit 250.174 Partikeln mit klaren Domänenstrukturen und aufgelösten Helices. Die 2D-Klassifizierung dieser Klasse zeigte eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses der Klassendurchschnitte. Diese Partikel wurden dann in RELION-3.1.162 mithilfe von pyem und dem Skript csparc2star.py von Daniel Asarnow importiert: Daniel Asarnow, Eugene Palovcak und Yifan Cheng (2019). asarnow/pyem: UCSF pyem v0.5 (v0.5). Zenodo. https://doi.org/10.5281/zenodo.3576630. Die Verfeinerung und weitere Kartenverbesserung wurde wie in 63 und in der ergänzenden Abbildung 7 beschrieben durchgeführt. Dies ergab eine Karte mit einer Auflösung von 3,5 Å.

Wir haben 22.293 Filmstapel im MRC-Format auf einem Titan KRIOS 300 kV Kryo-TEM bei eBIC (Diamantlichtquelle, BI21809-34- und BI21809-35-Sitzungen) gesammelt, ausgestattet mit einem K3-Detektor, der im Super-Resolution-Bin-2x-Modus betrieben wird, bei a Nennvergrößerung von 165 kx, was eine Pixelgröße von 0,513 Å pro Pixel ergab. Die Verarbeitung dieser Daten erfolgte ähnlich wie beim MuvB-apo-Komplex mit den unten und in den ergänzenden Abbildungen 4 und 5 erläuterten Variationen.

2D-Klassendurchschnitte zeigen eine deutliche zusätzliche Dichte, die aus dem Nukleosom herausragt (ergänzende Abbildung 4E). Die Ab-initio-Rekonstruktion mit anschließender 3D-Klassifizierung ermöglichte die Entfernung teilweise zerlegter Nukleosomen und Apo-Nukleosomenpartikel aus einer MMBcore:Nukleosomen-Komplexrekonstruktion (ergänzende Abbildung 4C). Eine weitere 3D-Klassifizierung dieser Klasse zeigt eine hohe Mobilität eines Teils des MMBcore in Bezug auf das Nukleosom (ergänzende Abbildung F). Wir haben diesen hochmobilen Teil des Komplexes MuvBHEAD genannt. Von vier 3D-Klassen zeigte eine eine klarere Dichte sowohl in MuvBHEAD als auch in einem anderen Teil des MMBcore-Komplexes, hier MuvBTAIL genannt, der in die Nukleosomenscheibe eingebettet ist (Abb. 1B und ergänzende Abb. 4F). Durch 3D-Verfeinerungen mit Schwerpunkt auf MuvBHEAD und MuvBTAIL konnten wir Rekonstruktionen mit Auflösungen von 7,5 bzw. 8,7 Å erhalten (ergänzende Abbildungen 5A – D, J). Für Strukturstudien zu den MuvB:Nukleosomen-Wechselwirkungen haben wir zusätzliche 29.102 Filmstapel gesammelt. Partikeldaten aus der Klasse MMBcore:Nucleosome, die nach der 2D- und 3D-Klassifizierung in diesem zweiten Datensatz erhalten wurden, wurden mit dem ersten Datensatz in dem in der ergänzenden Abbildung 4C angegebenen Stadium zusammengeführt. Eine zusätzliche 3D-Klassifizierung ergab 237.061 Partikel des MMBcore:Nukleosomenkomplexes (ergänzende Abbildungen 5 und J). Weitere fokussierte 3D-Verfeinerungen wurden verwendet, um MMBcore:DNA-, NCP147-, NCP:LIN9CTD- und NCP127-Karten zu erhalten (ergänzende Abbildung 5E – J).

Die PDB 4PC0 wurde als erste Vorlage für den Aufbau von RbBP4 in der MuvB-apo-Struktur in Coot64 verwendet. LIN9 DIRP, Tudor-Domäne und LIN37-Mitteldomäne sowie prolinreiche Schleife wurden de novo basierend auf der hervorragenden Qualität unserer Kryo-EM-Karte erstellt. Die Verfeinerung des Strukturmodells wurde mit PHENIX Real-Space Refinement65 mit einer Auflösung von 3,5 Å durchgeführt.

Diese Struktur wurde in die MuvBHEAD-Komplexkarte (ergänzende Abbildung 5B) mit starrem Körper eingepasst, wo eine zusätzliche geknickte Helix des LIN37CTD (Reste 203–246, vorhergesagt von AlphaFold51) eingepasst werden konnte. Dies wurde auch von unserem XL-MS geleitet Daten (Abb. 3b). PDB 6C48 wurde in die MuvBTAIL-NCP-Karte eingepasst (Abb. c und d). Die Verbindung von MuvB HEAD und TAIL über die LIN9-Schleife wird modelliert, um die Konnektivität zwischen diesen Modulen zu zeigen. PDB 6PWE wurde als erste Vorlage zur Modellierung des NCP-DNA-Komplexes verwendet.

Das AlphaFold-Modell des LIN9CTD:LIN54CTD-Subkomplexes wurde durch Übermittlung der LIN9-Reste 421–542 und LIN54-Reste 635–749 an AlphaFold51 erhalten. Die Vorhersage dieses Unterkomplexes weist insgesamt eine hohe Punktzahl auf, wie anhand des Tests zur vorhergesagten lokalen Distanzdifferenz beurteilt wird.

Sofern nicht anders angegeben, wurde NCP oder DNA mit MuvB- oder MMB-Komplex im Verhältnis 1:0 (Eingangskontrolle) oder 1:1, 1:2, 1:4 gemischt. Die Konzentration an NCP bzw. DNA lag konstant bei 0,5 μM. Die Reaktionen wurden mit Puffer, der 20 mM HEPES pH 8, 50 mM NaCl und 0,5 mM TCEP enthielt, aufgefüllt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 5 % (v/v) Saccharose wurden die Proben durch Gelelektrophorese unter Verwendung von entweder 5 % TBE-Polyacrylamid-Gel oder 1 % TBE-Agarose-Gel aufgetrennt. Die Gele wurden mit SYBR Safe gefärbt und entweder mit einem Typhoon FLA 9500 Imager oder einem Biorad ChemiDoc-System gescannt. Die Quantifizierung wurde mit ImageLab (Biorad) durchgeführt. Die Bandenintensitäten von ungebundenem NCP oder DNA wurden relativ zur Intensität der NCP- oder DNA-Bande in Abwesenheit des untersuchten Proteinkomplexes normalisiert und als Prozentsatz der ungebundenen NCP/DNA-Fraktion aufgetragen. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

NCP167 wurde mit MMBcore in einer Konzentration von 0,5 bzw. 1,25 μM gemischt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. H1 wurde auf die Mischung mit Endkonzentrationen von 0,25, 0,5 und 0,75 μM titriert. Nach weiteren 15 Minuten Inkubation wurde Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 5 % (Vol./Vol.) zugegeben und die Proben wurden auf einem 1 % TBE-Agarose-Gel analysiert. Das Gel wurde 3,5 Stunden lang bei 4 °C und 100 V betrieben. Das Gel wurde mit SYBR Safe gefärbt und mit dem Typhoon FLA 9500 Imager gescannt.

NCP, das die CHR-Sequenz enthielt, wurde mit MuvB in einer Konzentration von 0,5 bzw. 1,5 μM gemischt. LANA-Peptid wurde auf die Mischung mit Endkonzentrationen von 100, 200 und 300 μM titriert. Nach 15-minütiger Inkubation wurde Saccharose bis zu einer Endkonzentration von 5 % (v/v) zugegeben. Die Proben wurden auf einem 5 %igen nativen PAGE-Gel analysiert. Das Gel wurde 1,5 Stunden lang bei 4 °C und 100 V betrieben. Das Gel wurde mit SYBR Safe gefärbt und mit dem Typhoon FLA 9500 Imager gescannt.

Ähnlich dem oben für Apo-MuvB beschriebenen Vernetzungsprotokoll wurden 30 μl frisch gereinigter MuvB-Komplex mit einer Konzentration von 28 μM mit 0,75 μl DSSO (Disuccinimidylsulfoxid) (A33545, Thermo Scientific), vorgelöst in DMSO, inkubiert eine Konzentration von 100 mM. Die Probe wurde 10 Minuten lang auf Eis inkubiert, gefolgt von einem Abschrecken mit 2 μl 500 mM Tris pH 8 und einer sofortigen SEC auf einer Superose 6 3.2/300-Säule (GE Healthcare) in Puffer mit 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 0,2 mM TCEP. Eluierte Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und geeignete MuvB-Monomer enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und auf 20 μl konzentriert und wie oben beschrieben erneut auf die SEC-Säule injiziert, um etwaige Verunreinigungen höherer Ordnung zu entfernen. Die Monomere enthaltende Fraktion wurde durch Massenspektrometrie wie folgt analysiert.

Nach der Vernetzungsreaktion wurde der Probe Triethylammoniumbicarbonatpuffer (TEAB) in einer Endkonzentration von 100 mM zugesetzt. Die Proteine ​​wurden mit 5 mM Tris-2-carboxyethylphosphin (TCEP) und 10 mM Iodacetamid (IAA) gleichzeitig für 60 Minuten im Dunkeln reduziert und alkyliert und über Nacht mit Trypsin bei einer Endkonzentration von 50 ng/μl (Pierce) verdaut. Die Probe wurde getrocknet und die Peptide wurden mit Umkehrphasenchromatographie (RP) bei hohem pH-Wert unter Verwendung der XBridge C18-Säule (2,1 × 150 mm, 3,5 μm, Waters) auf einem Dionex UltiMate 3000 HPLC-System fraktioniert. Die mobile Phase A war 0,1 % v/v Ammoniumhydroxid und die mobile Phase B war Acetonitril, 0,1 % v/v Ammoniumhydroxid. Die Peptide wurden mit 0,2 ml/min mit dem folgenden Gradienten fraktioniert: 5 Min. bei 5 % B, bis zu 12 % B in 3 Min., für 32 Min. Gradient auf 35 % B, Gradient auf 80 % B in 5 Min., isokratisch für 5 Minuten und erneutes Äquilibrieren auf 5 % B. Die Fraktionen wurden alle 42 Sekunden gesammelt, mit SpeedVac getrocknet und zur MS-Analyse orthogonal in 12 Proben gepoolt.

Die LC-MS-Analyse wurde mit dem Dionex UltiMate 3000 UHPLC-System in Verbindung mit dem Orbitrap Lumos-Massenspektrometer (Thermo Scientific) durchgeführt. Jede Peptidfraktion wurde in 30 μl 0,1 % Ameisensäure rekonstituiert und 15 μl wurden auf die Acclaim PepMap 100, 100 μm × 2 cm C18, 5 μm Trapping-Säule mit einer Flussrate von 10 μl/min von 0,1 % Ameisensäure-Ladepuffer geladen. Anschließend wurden die Peptide einer Gradientenelution auf der Acclaim PepMap (75 μm × 50 cm, 2 μm, 100 Å) C18-Kapillarsäule unterzogen, die mit einem Edelstahlemitter mit integrierter Flüssigkeitsverbindung (Kat.-Nr. PSSELJ, MSWIL) auf dem EASY-Spray verbunden war Quelle bei 45 °C. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % Ameisensäure und die mobile Phase B aus 80 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure. Die Gradiententrennungsmethode bei einer Flussrate von 300 nL/min war wie folgt: 95 Minuten lang Gradient von 5 auf 38 % B, 5 Minuten lang bis zu 95 % B, 5 Minuten lang isokratisch bei 95 % B, erneute Äquilibrierung auf 5 % B in 5 Minuten, 10 Minuten lang isokratisch bei 5 % B. Vorläufer zwischen 375 und 1600 m/z und einer Ladung gleich oder höher als +3 wurden mit einer Auflösung von 120.000 im Höchstgeschwindigkeitsmodus in 5 Sekunden ausgewählt und für die CID-Fragmentierung isoliert ( Kollisionsenergie 25 %) mit Quadrupol-Isolationsbreite 1,6 Th und Orbitrap-Detektion mit 30.000 Auflösung. Fragmente mit einem angestrebten Massenunterschied von 31,9721 (DSSO-Vernetzer) wurden außerdem einer CID-Fragmentierung auf MS3-Ebene mit einer Kollisionsenergie von 35 %, einer Ionenfallenerkennung, einer maximalen IT von 50 ms, einer AGC von 2 × 104 und einem MS2-Isolationsfenster von 2 Th unterzogen. Es wurden zwei Vorläufergruppen mit beiden Ionen im Paar ausgewählt. Gezielte MS-Vorläufer wurden zur weiteren Isolierung und Aktivierung für 30 s mit einer Massentoleranz von 10 ppm dynamisch ausgeschlossen.

Die Identifizierung vernetzter Peptide wurde in Proteome Discoverer 2.4 (Thermo) mit der Xlinkx-Suchmaschine im MS2_MS3-Modus durchgeführt. Die Massentoleranzen für Vorläufer, FTMS und ITMS betrugen 20 ppm, 30 ppm bzw. 0,5 Da, wobei maximal 2 Trypsin-fehlende Spaltungen zulässig waren. Carbamidomethyl bei C und Oxidation bei M wurden als statische bzw. dynamische Modifikationen ausgewählt. Die Spektren wurden anhand einer FASTA-Datei durchsucht, die die Sequenzen der Proteine ​​im Komplex sowie eine zufällige Auswahl von etwa 1000 Escherichia coli UniProt-Einträgen als zusätzliche Negativkontrolle der Crosslink-Übereinstimmungen enthielt. Vernetzte Peptide wurden bei FDR < 0,01 mithilfe der Percolator-Knoten- und Täuschungsdatenbanksuche gefiltert.

Aufgrund der hohen Flexibilität zwischen MuvBHEAD und MuvBTAIL (Ergänzende Abbildung 4F) wurden die Querverbindungen zwischen diesen beiden Modulen von der strukturellen Interpretation ausgeschlossen (Ergänzende Abbildung 6B und Ergänzende Daten 1).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Die Strukturkoordinaten und EM-Daten wurden in der Proteindatenbank und in der Elektronenmikroskopie-Datenbank mit den folgenden Zugangsnummern hinterlegt: Der MuvB-Apo-Komplex (einschließlich LIN9 DIRP und Tudor, RbBP4 und LIN37 MD-PRL) ist in PDB hinterlegt -ID 7R1D, EMD-14239. Die MMBcore:NCP-Komplex-EM-Karten sind in EMD-15709 hinterlegt. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE66-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD031421 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36061-7

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Referenzen herunterladen

Wir danken Basil J. Greber für seine unschätzbaren Ratschläge zur Datenverarbeitung und Sammlung der MuvB-Apo-Komplexstruktur. Wir danken Chris Richardson für die hervorragende IT-Unterstützung. Wir danken Thangavelu Kaliyappan für die Bereitstellung von Histon-Expressionskonstrukten. Wir danken Stephen Hearnshaw für seine Hilfe bei der Massenphotometrie. Wir danken Michael Ranes und Sebastian Guettler für seine Hilfe bei den SEC-MALS. Wir danken Ruth Knight für ihre Hilfe bei der Insektenzellkultur. Wir danken Alex Radzisheuskaya, Basil J. Greber und Alessandro Vannini für die kritische Lektüre und Kommentierung dieses Manuskripts. Wir danken David Barford für die Diskussionen und dafür, dass er CA ermöglicht hat, dieses Projekt in seinem Labor zu starten. Wir danken Diamond für den Zugang und die Unterstützung der Kryo-EM-Einrichtungen im britischen National Electron Bio-Imaging Centre (eBIC), Vorschlag BI21809-34, finanziert vom Wellcome Trust, MRC und BBSRC. Wir danken dem lokalen eBIC-Kontakt Yuewen Sheng für seine großartige Hilfe beim Sammeln der MMBcore:NCP-Datensätze. Wir danken Christos Savva und dem Leicester Institute of Structural and Chemical Biology (Universität Leicester) für ihre großartige Hilfe bei der Sammlung vorläufiger Daten zu diesem Projekt. MGK und CA werden durch das Sir Henry Dale Fellowship 215458/Z/19/ZRM unterstützt, das durch das Institute of Cancer Research (ICR) unterstützt wird, die vergebene Fördernummer ist GFR146X. Die Arbeit von TIR und JSC wurde durch den Zuschuss des CRUK Centre mit der Referenznummer C309/A25144 finanziert.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Marios G. Koliopoulos, Reyhan Muhammad.

Abteilung für Strukturbiologie, Chester Beatty Laboratories, The Institute of Cancer Research, London, Großbritannien

Marios G. Koliopoulos, Reyhan Muhammad, Fabienne Beuron und Claudio Alfieri

Funktionelle Proteomik, Chester Beatty Laboratories, Abteilung Krebsbiologie, The Institute of Cancer Research, London, Großbritannien

Theodoros I. Roumeliotis und Jyoti S. Choudhary

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CA klonierte und rekonstituierte ein anfängliches MuvB-Konstrukt, das von MGKMGK weiter optimiert wurde, rekonstituierte alle in diesem Manuskript gezeigten MuvB-Komplexe und führte biochemische und biophysikalische Tests durch. RM rekonstituierte Nukleosomen und Nukleosomenkomplexe mit MuvB-Komplexen, führte biochemische Tests und GraFIX durch. FB bereitete Gitter eines anfänglichen MuvB-Komplexkonstrukts vor und fand eine Ausgangsbedingung für Kryo-EM-Gitterpräparationen des MuvB-Apo-Komplexes. Dieser Zustand wurde durch von CA, MGK und RMMGK vorbereitete Kryo-EM-Gitter des Apo-MuvB-Komplexes weiter optimiert. RM und MGK erstellten Gitter des MMBcore:Nukleosom-Komplexes. CA koordinierte die EM-Pipeline, überprüfte die Kryo-EM-Gitter, sammelte Kryo-EM-Daten und verarbeitete die Kryo-EM-Daten. CA führte die Interpretation und Erstellung des Strukturmodells mit Eingaben von MGK und RMTIR durch, und JSC führte bzw. überwachte die MS-Analyse der MuvB-Apo-Probe. CA leitete das Projekt und entwarf Experimente mit MGK und RMCA bereitete das Manuskript vor und schrieb das Manuskript mit Hilfe von MGK und RM

Korrespondenz mit Claudio Alfieri.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Koliopoulos, MG, Muhammad, R., Roumeliotis, TI et al. Die Struktur eines Nukleosomen-gebundenen MuvB-Transkriptionsfaktorkomplexes zeigt DNA-Remodellierung. Nat Commun 13, 5075 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32798-9

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Eingegangen: 23. Februar 2022

Angenommen: 15. August 2022

Veröffentlicht: 29. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32798-9

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